cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA(1μg/μl)10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)1μl1mol/LTris-HCl(pH8.0,37℃)2.5μl1mol/LKCl3.5μl250mmol/LMgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1mol/LDTT2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl[α-32P]dCTP（400Ci/mmol,10mCi/ml）。3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl0.25mol/LEDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10min，然后转移至冰上。5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。[阶段2：cDNA第二链的合成]1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：10mmol/LMgCl270μl2mol/LTris-HCl(pH7.4)5μl10mCi/ml[α-32P]dCTP（400Ci/mmol）10μl1mol/L(NH4)2SO41.5μlRNaseH(1000单位/ml)1μl大肠杆菌DNA聚合酶I(10000单位/ml)4.5μl温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：β-NAD(50mmol/L)1μl大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml)1μl室温温育15min。3．温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μlT4噬菌体DNA聚合...
