解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1DNA甲基化检测（重亚硫酸盐法）1.实验原理DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。重亚硫酸盐可使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，经PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，通过甲基化引物和非甲基化引物条带亮度，判断该位点甲基化程度。对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,还可判断是否发生了甲基化。此方法精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐，适用于少量基因的检测，不建议大规模分析。2.实验目的在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂细胞裂解液，蛋白酶K，酚氯仿（pH>7.5），氯仿，3MNaAc；无水乙醇，70%乙醇，ddH2O。3.2.主要仪器水浴锅，EP管等。4.实验步骤(1)基因组DNA抽提1)收集0.5-1*106个细胞于EP管内，用PBS悬浮清洗，离心去上清；2)加入500μL细胞裂解液和10μl蛋白酶K，重悬细胞，56°水浴锅内孵育1h，每解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2隔10min翻转一次;3)加入500μL酚氯仿，翻转混匀10min，12000rpm离心10min；4)剪掉枪头尖端，将上清转移至另一EP管中；5)加入等体积氯仿，翻转混匀10min后，12000rpm离心10min；6)剪掉枪头尖端，小心将上清转移至另一EP管内；7)加入1/10体积3MNaAc，混匀；8)加入2倍体积预冷无水乙醇，混匀，12000rpm离心10min；9)倒掉上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min；10)倒掉上清，加无水乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min；11)倒掉上清，晾干乙醇后，加适量ddH2O溶解；12)测定浓度并电泳。(2)重亚硫酸盐转化A．提前准备：DNAwashbuffer：按照说明书，向DNAwashbuffer瓶中加入规定量的乙醇，并标记。18-25°可放置6个月。解螺旋http://www.helixlife.cn/3NNaOH：称取3gNaOH，溶于25mLddH2O脱盐溶液（desulfonationsolution）：900μL100%乙醇+100μL3NNaOH。每个反应使用220μL。DNA转化试剂的溶解：CAUTION:粉末状...
