B淋巴细胞分离技术一、实验原理膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下：二、实验材料1冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。2pH值72Hanks液，含5%小牛血清。3淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±00024吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片三、实验步骤1、取肝素抗凝血2ml，用Hanks液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。3、再用经37℃预热的Hanks液(含5%小牛血清)洗涤离心4、取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，在荧光显微镜下观察。四、结果观察凡淋巴细胞表面粘附5个以上菌体细胞为SmIg阳性。一般先用暗视野计算荧光阳性细胞数，继用明视野计算同一视野中淋巴细胞总数。每份标本至少计算200个淋巴细胞，并求出荧光阳性细胞百分率，同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的绝对值。同时，每个B淋巴细胞表面可带有不同类别的Ig，即IgM、IgG、IgA等，如果分别用单价荧光抗Ig血清染色，则可鉴定不同Ig的B淋巴细胞。但淋巴细胞数量的多少会影响检出率。过多或过少时，除难以计数外，染色背景明暗不匀，着色与不着色的细胞难以区别，一般以2～25×106/ml细胞浓度为宜，活细胞数应不少于95%。五、实验分析此法特异性强，荧光亮度好，操作迅速简便。加上试剂有商品供应，可以使本法标准化。一般SmIg阳性的B淋巴细胞表面或周围均可布满许多黄绿色荧光菌体，很少见到表面只粘附2～3个菌体...
