YYSWDB0091蛋白质含量测定考马斯亮蓝G250染色法YY-SW-DB-0091蛋白质含量测定考马斯亮蓝G250染色法1.范围本方法采用蛋白质与考马斯亮蓝染色-分光光度法测定蛋白质含量本方法适用于各类蛋白质测定蛋白质浓度范围为0.01mgmL-11.0mgmL-12.原理2.1蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化从而改变这些染料的光吸收在此基础上发展了蛋白质染色测定方法涉及的指示剂有甲基橙考马斯亮蓝溴甲酚绿和溴甲酚紫目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝2.2考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律可在595nm处比色测定25分钟即呈最大光吸收至少稳定1小时该法操作简便迅速消耗样品量少但不同蛋白质之间差异大且标准曲线线性差高浓度的TrisEDTA尿素甘油蔗糖丙酮硫酸铵和去污剂对测定有干扰缓冲液浓度过高时改变测定液pH值会影响显色考马斯亮蓝染色能力强比色杯不洗干净会影响光吸收值不可用石英杯测定3.试剂考马斯亮蓝G-250sigma95乙醇磷酸牛血清白蛋白sigma4仪器72型分光光度计5.试样制备5.1染色液取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95乙醇中加100mL85磷酸加水稀释至1升该染色液可保存数月若不加水可长期保存用前稀释5.2标准蛋白溶液0.5mgmL-1牛血清白蛋白6.操作步骤6.1取ll支试管16150mm编号依次分别加入00.050.10,0.l50.200.25,0.300.350.400.450.5OmL标准蛋白溶液用水补足到0.50mL加0.3mL染色液立即摇匀置室温2025放置15分钟然后于595nm波长处比色另取O.5mL未知浓度的蛋白溶液同上测定从其A595nm值推算出其浓度大小注意因标准曲线的线性较差应及时校正同时显色受时间与温度影响较大控制在同一条件下操作7.结果计算以A595nm为y轴牛血清白蛋白含量为x轴画出标准曲线然后在标准曲线上查出未知样品的浓度8.参考文献1李如亮主编.生物化学实验.武汉武汉大学出版社1998.37-582张龙翔等主编.生化实验方法和技术.北京高等教育出版社1997.136-1443李建武等合编.生物化学实验原理和方法.北京北京大学出版社1994.150-174
