解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1GST-pulldown实验1.实验原理利用重组技术将目标蛋白与GST（GlutathioneStransferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。分离所得的蛋白再进行Westernblotting，即可检测与目标蛋白有相互作用的蛋白。例，验证蛋白质A和蛋白质B的相互结合作用。需要构建A（或B，即A、B选一个即可）与GST融合的重组质粒，然后通过pulldown，把表达出来的GST-A融合蛋白拉下来（同时与A有相互结合作用的蛋白也会被拉下来），通过Westernblotting，用B抗体检测拉下来的蛋白，就能确定这些被拉下来的蛋白里是否有B，如果有标明，A、B存在相互结合作用。2.实验目的体外验证蛋白质A与蛋白质B的相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用。3.实验材料3.1主要试剂Glutathione琼脂糖珠、细胞裂解、细胞裂解等。3.2主要仪器摇床、离心机等。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.实验步骤4.1构建GST融合目的蛋白A重组质粒（质粒A）并获得融合蛋白A解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn21.将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株2.挑取单个克隆到含有5mlLB(100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜3.将培养菌液转移到含有500mlLB(100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置过夜。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS1%Triton-100PMSF），吹打混匀。5.冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分澄清。6.11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清，-80℃保存备用。4.2真核融合蛋白B的获得将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上（见分子克隆），进行细胞转染（见质粒转染）（此步可选，若目标细胞中，B蛋白表达比较高，且比较好检测，则可以不用构建这个带标签的外源表达质粒转染细胞，直接用细胞裂解液即可）4.3GST-pulldown1.取适量融合蛋白GST-A冰上冻融。2.取50-70ulGST-Beads（ImmobilizedGlutathione）到EP管中，用800ulPBS1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜...
