ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。试剂器材1.试剂(1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000ml(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15MKH2PO40.2克Na2HPO4·12H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05％0.5ml加蒸馏水至1000ml(3)稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。(4)终止液(2MH2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2MNa2HPO4(28.4克／L)25.7ml0.1M柠檬酸(19.2克／L)24.3ml加蒸馏水50ml。（6）TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75％H2O232μl(7)ABTS使用液:ABTS0.5mg底物缓冲液(PH5.5)1ml3％H2O22μl（8）抗原、抗体和酶标记抗体。(9)正常人血清和阳性对照血清。2.器材:(1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料...
