解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1细胞凋亡检测（TUNEL法）1.实验原理细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNAladder。基因组DNA断裂时，会暴露出3'-OH基团。利用末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)催化，将可观测的标记物，如荧光素等标记到暴露的3'-OH上，再通过荧光检测装置获得具体的数值，便可获得细胞凋亡情况的数据，这就是TUNEL(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细胞凋亡的原理。由于正常的或者处于增殖的细胞几乎没有DNA断裂，坏死的细胞也很少DNA断裂，没有3'-OH形成，很少能够被染色，因此，TUNEL法能够特异性检测凋亡细胞。TUNEL法灵敏度高，特异性好，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞，在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。目前TUNEL一般使用过氧化物酶标记法：利用TdT的催化给DNA3'-OH基团加上标记物（如地高辛、生物素等）标记的dUTP，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin(Streptavidin-HRP)结合，然后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞。2.实验目的检测组织或细胞中，细胞凋亡情况.解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂市面上有很多TUNEL试剂盒，可直接购买使用，不需要自行配置试剂3.2.主要仪器荧光显微镜解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn24.实验步骤（来源于碧云天TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书，若采购其他品牌试剂盒，按说明书操作即可）4.1样品预处理1.对于贴壁细胞或细胞涂片：a.用PBS缓冲液洗涤1次。b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。c.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30分钟。d.用PBS或HBSS洗涤1次。e.加入碧云天生产的免疫染色强力通透液(P0097)或含0.3%TritonX-100的PBS，室温孵育5分钟。f.用PBS或HBSS洗涤1次。g.在碧云天生产的内源性过氧化物酶封闭液(P0099)或PBS配制的0.3%过氧化氢溶液(0.3%H2O2inPBS)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用PBS或HBSS洗涤3次。h.转步骤5。2.对于悬浮细胞或细胞悬液：a.收集细胞(不超过200万细胞)，用PBS或HBSS洗涤1次。b.涂片，使细胞粘附在载玻片上。可以干燥样品使细胞贴得更牢，或使用适当的粘附试剂。解螺旋http://www.helixlife.cn/c.用碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定细胞30分...
