MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽滤除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（适用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。5）每孔加入180ul新鲜RPMI1640培养液，再加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。6）终止培养（可离心，1000rpm，10min），小心吸去孔内培养液。7）每孔加入150ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%MTT，量为20ul/孔。4）如果不使用96孔板，培养基超过100ml，MTT按照10%的比例加入。5）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。6）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SD...
