解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1qPCR检测实验1.实验原理在单管PCR的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次PCR循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次PCR荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct值越小。当维持PCR分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的检查目的基因的mRNA表达水平。3.实验材料3.1.主要试剂（试剂来源仅供参考）试剂来源Cat.No.TrizolInvitrogen15596-026三氯甲烷Bio-RadMSB1001Nuclease-FREEWaterInvitrogenAM9938异丙醇国药集团化学试剂有限公司80109218乙醇国药集团化学试剂有限公司10009218DEPC处理的水碧云天M-MLVpromegaM1705dNTPpromegaU1240oligodT上海生工B0205RnaseInhibitorpromegaN2115GXDkitiqSYBRGreenBio-Rad1708882AP解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2GXD封膜Bio-RadMSB1001PCR无色薄壁管（平盖）AXYGENUS-PCR-02-C3.2.主要仪器（仅供参考）解螺旋http://www.helixlife.cn/仪器名称来源型号离心机ThermoMicro17RqPCR仪BioradCFX96酶标仪BioTekEpoch-256600电泳仪上海天能EPS-300凝胶成像系统上海天能Tanon-6003.3qPCR引物一般可让公司设计，也可以自己设计，设计步骤详见解螺旋《酸谈实验室》（视频教程）。4.实验步骤（步骤1-8为细胞样品RNA抽提步骤（组织样品参见附件《哺乳动物组织总RNA提取》，其余步骤相同），步骤9-13为反转录制备cDNA步骤，步骤15-17为qPCR检测步骤）整个实验操作在超净工作台中进行，操作前对台面进行20min的紫外照射灭菌消毒，相关实验器材75%乙醇擦拭消毒。除特殊说明外，所有的操作在室温的条件下完成。1.细胞样品的裂解：在6孔板中加入1mlTrizol/孔，匀速吹打后室温静置5min，转移至新的1.5mlEppendorf管中。2.每管加入200µl氯仿，用手振摇Eppendorf管15秒，室温静置10min，4℃，12000rpm，离心15min。3.此时管内物质分成三层，使用1000μl枪头吸取上层液体400μl，移至新的1.5mlEppendorf管，每管加入200µl氯仿，用手振摇Eppendorf管15秒，室温静置10min，4℃，12000rpm，离心15min。4.使用200μl枪头吸取上层液体200μl，移至新的1.5mlEppendorf管，...
