siRNA表达载体的构建siRNA表达载体构建可以：（1）作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；（2）应用于基因组学、细胞信号传导通路分析；（3）用于药物靶点筛选、疾病治疗。实验方法原理:多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。实验材料:目的基因试剂、试剂盒：LB培养基仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、漩涡振荡仪等实验步骤：一、目的基因的确定1.检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）。2.NCBI查阅：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。3.搜索引擎辅助：http://www.google.cn/orhttp://scholar.google.com。二、设计siRNA靶序列在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。1.选择siRNA靶位点从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions,UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。2.序列同源性分析将潜在的序列和相应的基因组数据库（人或者小鼠、大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚，可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。通常来说，每个目标序列设计3-4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。3.设计...
