NEBmRNA建库protocol一、RNA质检要求：RIN>7；10ng-1ug。二、mRNAisolation，fragmentationandPriming：准备第一链反应缓冲液和随机引物mix(pink)NEBNextFirstStrandSynthesisReactionBuffer(5X)4µl(pink)NEBNextRandomPrimers1µlNuclease-freewater5ulTotalVolume10ulNote：在mRNA分离中，要保持mix在冰上。1.用nuclease-freewater稀释RNA至25ul（新的PCR管），冰上操作。（样品多的情况下，用排管做）。2.分装7.5ulNEBNextOligod(T)beads至一个新的200ulPCR管（排管操作）。3.Add50µlRNABindingBuffer至beads，用枪吸打6次混匀。4.至于磁力架上2min，RT。5.弃上清。6.从磁力架上去下管子。7.重复清洗一遍，step3-6.8.用25ulRNABindingBuffer重悬磁珠，加入step1稀释好的RNA样品，混匀。9.65℃，5min，hold4℃。（PCR仪上操作）10.当温度降到4℃，将样品取出。11.室温静置5min。12.磁力架上2min。13.弃上清。14.从磁力架上取下PCR管。15.Add100ulWashBuffer清洗磁珠，用枪混匀6次。16.磁力架上2min。17.弃上清。18.从磁力架上取下PCR管。19.重复清洗一次，重复step15-18.20.Add25ulTrisBuffer，用枪轻柔混匀6次。21.80℃，2min，hold25℃。（PCR仪上操作）22.当温度降到25℃后，取出样品。23.Add25RNABindingBuffer，用枪轻柔混匀6次。24.室温静置5min。25.磁力架上2min。26.弃上清。27.从磁力架上取下PCR管。28.Add100ulWashBuffer，用枪轻柔混匀6次。29.磁力架上2min。30.弃上清。31.磁力架上取下管子。32.Add100ulTrisBuffer清洗beads，用枪轻柔混匀6次。33.磁力架上2min。34.弃上清。（Caution：上清要弃干净，勿将磁珠吸走。）35.磁力架上取下管子。36.Add7.5ultheFirstStrandSynthesisReactionBufferandRandomPrimermix(2X)preparedatthestartoftheprotocol溶解磁珠。94℃孵育12min。立即将管子至于磁力架上。37.转移5ul上清（纯化的mRNA）至于新的PCR管（PCR单管）。38.置于冰上。39.ProceedtoFirstStrandcDNASynthesis三、FirstStrandcDNASynthesis1.在上一步骤的5ul上清中，加入以下组分：(pink)MurineRNaseInhibitor0.25µl(pink)ProtoScriptIIReverseTranscriptase0.5µlNucleasefreewater4.25µlFinalvolume10µl2.在PCR仪中按以下步骤孵育样品：10minutesat25°C50minutesat42°C15minutesat70°CHoldat4°C3.马上进行secondstrandsynthesisreaction.四、PerformSecondStrandcDNASynthesis1.在上一步骤10ul反应液中加入以下组分：...
