近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据每次结果调整。其中两张片子的压法如下描述:先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。现象---------------------原因-------------------------------解决反影(白色条带,黑色背景)-------1HRP过高(背景较高)---------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色------2HRP过高(敏感性太高)--------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无-----------------3HRP过高引起底物迅速耗竭----------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3-------------------------4抗体-抗原系统敏感性过低----------提高抗体浓度/蛋白上样量*注4------------------------5转膜不充分/过转------------------优化转膜条件*注5------------------------6HRP或底物活性降低-----------------测试活性或选用敏感底物*注6高背景-------------------7HRP过高(背景较高)--------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7--------------------------8封闭时间不足------------------延长封闭时间4度过夜最好*注8-------------------------9抗体与封闭液有交叉------------...
