细胞的冻存细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。总的原则是缓慢冻存！！！一材料：生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。二步骤：2.1冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形,最好细胞应该处于对数生长期。2.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。2.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度。2.4.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。2.5接着置于-20℃冰箱，约30-60min。2.6.置于-80超低温冰箱中放置过夜。2.7.置于液氮罐中长期保存。2.8同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。三注意事项：3.1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存，提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定，但是好多人认为小牛血清含量越高越好！3.2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。可以先在泡沫上打孔，把冻存管塞进去。这样降温可以慢一点，当然包上棉花也是不错的主意3.3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。3.4-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍內直接放入-80°C冰箱中，但存活率會降低一些。但是大多数人：4度半小时，—20度半小时，—80度过夜，液氮保存。3.5冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml以上，冻存细胞健康程度一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存3.6细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积，原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存，这实际上并不好。原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，...
