磷酸化蛋白之westernblot检测操作细节和注意事项1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次（站长注：可加入防腐剂，如叠氮钠，ProclinTM等，保存时间更长）。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cellsignaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体4.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cellsignaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fatmilk的TBST。5.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。6.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。7.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对.8.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅.9.磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min3次即可,宁愿background深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。10.正如第5点所说的,"研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量“。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个gel，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗用strips...
