解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1染色质免疫沉淀(ChIP)实验1.实验原理ChIP是用于鉴定DNA与蛋白质体内相互作用的经典方法，也被应用于RNA与蛋白质的相互作用。ChIP实验技术原理如下：1.甲醛处理，使蛋白质与DNA交联；2.酶消化法／超声法处理染色质为150-900bpDNA-蛋白质片段(1~5个核小体单位)；3.通过特异性抗体(组蛋白或非组蛋白)捕获和沉淀蛋白质-DNA交联复合体；4.解除交联，纯化得到DNA，进行下游分析。2.实验目的ChIP技术主要应用于：转录因子结合分析、DNA复制与损伤相关因子与DNA相互作用分析、表观遗传学分析、DNA甲基化分析等。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂（试剂来源仅供参考）3.1.1.包含在试剂盒SimpleChIPTMEnzymaticChromatinIPKit(MagneticBeads)#9003:中的试剂：a.甘氨酸溶液(10X)#7005b.缓冲液A(4X)#7006c.缓冲液B(4X)#7007d.ChIP缓冲液(10X)#7008e.ChIP洗脱(缓冲)液(2X)#7009f.5MNaCl#7010g.0.5MEDTA#7011h.ChIP级蛋白G磁珠#9006i.DNA结合缓冲液#10007j.DNA漂洗缓冲液(使用前添加4倍体积无水乙醇)#10008k.DNA洗脱缓冲液#10009I.DNA纯化柱#10010m.蛋白酶抑制剂混合物PIC(200X)#7012解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2n.RNaseA(10mg/ml)#7013o.微球菌核酸酶(2000gelunits/ul)#10011(用来切割染色质的关键酶)p.蛋白酶K(20mg/mI)#10012q.SimpleChIPTM人RPL30外显子3引物#7014r.SimpleChIPTM人RPL30内含子2引物#7015s.组蛋白H3(D2B12)XPTM兔单抗(ChIP专用)#4620t.正常兔lgG#2729u.#7016,DTT粉末，192.8mg(4℃保存，溶解后-20℃保存)3.1.2.不包含在试剂盒SimpleChIPTMEnzymaticChromatinIPKit(MagneticBeads)#9003中的试剂：a.六孔磁性分离架#7017/十二孔磁性分离架#14654b.甲醛(37%)(福尔马林)c.乙醇(96-100%)d.1XPBS#9872e.无核酸酶的水#12931f.TaqDNA聚合酶g.dNTP混合液3.2.主要仪器离心机、金属浴加热器、超声仪、PCR仪等。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.实验步骤“酶”处理染色质免疫沉淀(磁珠式)操作方法Ⅰ.细胞交联和样品制备为了获得最优的ChIP结果，一个标准的ChIP反应需要约4X106个细胞处理后获得的染色质，以Hela细胞为例，15cm培养皿，90%生长密度下的细胞量约为8X106个细胞。在实际工作当中，建议每次实验处理足量的细胞用于满足后续多个免疫沉淀反应(如使用不同靶标蛋白抗体进行免疫沉淀，阴性对照(IgG)组，阳性对照组等)和技术性重复要求。可根据自己的实验设计...
