YYSWDB0093蛋白质含量测定紫外光谱215nm和225nm的吸收差法YY-SW-DB-0093蛋白质含量测定紫外光谱215nm和225nm的吸收差法1.范围本方法采用紫外吸收法测定蛋白质含量本方法适用于各类蛋白质适用蛋白质浓度范围为20gmL-1100gmL-12.原理2.1蛋白质分子中所含的酪氨酸和色氨酸残基使蛋白质在28Onm下具有最大吸收值这是因为两种氨基酸残基的苯环中含有共轭双键在一定的浓度范围内蛋白质溶液的280nm光吸收值与其浓度成正比因此可用作定量测定2.2蛋白质的肽键在200250nm有强的紫外吸收其光吸收强度与一定范围的蛋白质浓度成正比且波长越短光吸收越强若选用215nm可减少干扰及光散射用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比可减少非蛋白质成分引起的误差紫外吸收法操作简便快捷不消耗样品低浓度的盐类不干扰测定在生化研究中应用广泛尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测但也有相当的物质对紫外法有干扰如核酸等3.试剂氯化钠4.仪器紫外分光光度计5.试样制备5.1标准蛋白溶液牛血清白蛋白溶液用9mgmL-1的NaCl配制成浓度为1mgmL-1的溶液5.2待测蛋白溶液蛋白质浓度控制在1.5mgmL-12.5mgmL-1范围内6.操作步骤6.1方法是直接取蛋白质样品溶液选用1cm光径的石英比色杯以相应的溶剂作空白对照,分别读出其A215和A225即可求出蛋白质样品中的浓度7.结果计算7.1其经验公式蛋白质浓度mgmL-10.144A215A225或者用一已知浓度的蛋白质建立一系列不同浓度的溶液分别读其A215和A225然后以吸收差D215-D225为纵坐标蛋白质浓度为横座标制作标准曲线同样未知样品在测得吸收值以后可直接从标准曲线上查得其浓度本法灵敏度高且无蛋白质特异性NaCl硫酸铵0.1molL-1磷酸硼酸和Tris等均无显著干扰但0.1molL-1NaOH0.1molL-1乙酸琥珀酸柠檬酸邻苯二甲酸巴比妥等在215nm的光吸收较大必须降低其浓度在5mmolL-1以下才无显著影响8.参考文献1.李如亮主编.生物化学实验.武汉武汉大学出版社1998.37-582.张龙翔等主编.生化实验方法和技术.北京:高等教育出版社1997.136-1443.李建武等合编.生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社1994.150-174
