‐1‐凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移实验：凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。EMSA原理：凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针根据研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。EMSA原理示意图‐2‐实验基本步骤：一、探针的标记1、如下设置探针标记的反应体系：（1）待标记探针(1.75pmol/微升)：2微升。（2）T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)：1微升。（3）Nuclease-FreeWater：5微升。（4）[γ-32P]ATP(3000Ci/mmolat10mCi/ml)：1微升。（5）T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)：1微升。（6）总体积10微升（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4PolynucleotideKinase，混匀。2、使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。3、加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。4、再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。5、标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。二、探针的纯化通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：1、对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微...
