解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1实验名称1.实验原理慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因编辑载体,属于逆转录病毒科，为RNA病毒。区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前慢病毒被广泛地应用于表达RNAi以及cDNA过表达的研究中。2.实验目的通过慢病毒感染细胞，将外源基因整合到宿主染色体上，得到稳转株。用于后期研究使用。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂试剂名称来源Cat.No.血清BI04-001-1A病毒感染培养基：Opti-MEMGibco31985-070双抗HycloneSV30010胰蛋白酶HycloneSH30042PolybreneSigma1076893.2.主要仪器仪器名称来源型号生物安全柜苏净安泰BSC-B000IIA2二氧化碳培养箱Thermo311离心机上海卢湘仪公司TP25-ws显微镜OlympusCKX41解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.3.试剂配制10ug/ulPolybrene(2000X)配制：用超纯水溶剂Polybrene，浓度为10μg/ul,过滤除菌，分装成1ml/支。-20℃保持。调pH至7.4。4.实验步骤1.将处于对数期细胞用0.25%胰酶消化，1500rpm离心3min去上清，用培养基悬浮起来，制成细胞悬液。2.将血球技术板洗净擦干，吸取7.5μL细胞悬液，沿盖玻片一边缓慢加入细胞悬液，进行细胞计数。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.调整细胞密度，接种于6孔板中，组别设置：实验组、阴性对照组。4.待细胞贴避后，轻轻吸去培养基，小心加入1ml含5μg/mlPolybrene的Opti-MEM培养基，再加入计算出的病毒量（病毒所需体积=细胞MOI*种板量/病毒滴度），轻轻混匀后放入细胞培养箱培养。5.培养8h后，吸去上清，加入新鲜培养基，继续放回培养箱中，培养96h。6.荧光显微镜下观察荧光效率，由此判断感染效率（也可以用流式检测荧光感染效率）。5.应用示例文献1-31.LiZ,TianT,HuX,etal.TargetingSix1bylentivirus-mediatedRNAinterferenceinhibitscolorectalcancercellgrowthandinvasion.IntJClinExpPathol2014;7(2):631-9.2.LvM,LiY,TianX,etal.Lentivirus-mediatedknockdownofNLKinhibitssmall-celllungcancergrowthandmetastasis.DrugDesDevelTher2016;10:3737-46.3.PanY,WuA,XuF,ChenC,JiangL,JinR.Lentivirus-mediatedoverexpressionofmiR-124suppressesgrowthandinvasionbytargetingJAG1andEZH2ingastriccancer.OncolLett2018;15(5):7450-8.
