解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1第二代DNA测序技术1.实验原理Illumina/SolexaGenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。解螺旋http://www.helixlife.cn/IlluminaSolexa测序仪特点：桥式PCR边合成边测序可逆终止物IlluminaSolexa测序流程：2.实验目的获得待测DNA的序列信息。解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.实验材料3.1.主要试剂荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物，未标记的dNTP和普通Taq酶等。3.2.主要仪器玻璃管、PCR仪等。4.实验步骤4.1.测序文库的构建(LibraryConstruction)首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是GnomeAnalyzer系统所需的样品量可低至100ng，能应用在很多样品有限的实验中)，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头(Adaptor)。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小(Insertsize)对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insertsize，以便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。4.2.锚定桥接(SurfaceAttachmentandBridgeAmplification)Solexa测序的反应在叫做flowcell的玻璃管中进行，flowcell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。4.3.预扩增(DenaturationandCompleteAmplification)添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4.4.单碱基延伸测序(SingleBaseExtensionandSequencing)解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn3在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧...
