解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1慢病毒包装1.实验原理慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因编辑载体,属于逆转录病毒科，为RNA病毒。区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前慢病毒被广泛地应用于表达RNAi以及cDNA过表达的研究中。对于RNAi，由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。基于慢病毒载体设计的shRNA,转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使有效转染的细胞种类增加，而且长期稳定抑制目的基因在细胞中表达。2.实验目的包装慢病毒3.实验材料3.1.主要试剂和物料1.细胞株：293T，慢病毒的包装工具细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。2.载体：重组载体（包含shRNA或cDNA的载体）、辅助载体（对于3质粒系统，辅助载体有2个：pCMV△R8.92，含有病毒包装所需的gag/pol元件；pVSVG-I，含VSVG蛋白元件）解螺旋http://www.helixlife.cn/3.试剂：培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶、转染试剂（Lipofectamine2000）等解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.2.主要仪器荧光显微镜、高速冷冻离心机、细胞CO2培养箱、离心机、生物安全柜、超滤装置4.实验步骤4.1.慢病毒包装1.转染前24h，用胰蛋白酶消化处于对数生长期的293T细胞，进行细胞计数，用培养基调整细胞密度为6x106细胞/10ml，接种于10cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时用于转染。2.转染前2h将细胞培养基更换为基础培养基。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.无菌离心管中加入重组质粒和辅助质粒，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，在室温下温育（比例和时间可根据转染试剂说明书）。4.Lipofectamine2000摇匀后取50μl在另一管中与0.95mlOpti-MEM混合稀释，在室温下温育5分钟（可根据转染试剂说明书）。5.稀释后的DNA与Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，控制在5分钟之内。6.室温温育20分钟，充分形成DNA与Lipofectamine2000的转染复合物。7.将转染混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。8.8h后吸去混合培养基，每皿加入10ml的PBS液，轻轻晃动洗涤残余混和物，吸掉上清。每瓶细胞中加入培养基10ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48...
