解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1过表达载体构建（GOF）基因的过表达视频介绍，请见解螺旋在线视频课程酸谈实验室之基因表达操作篇1.实验原理过表达载体的构建是一个利用切、接、转、增、检等基因工程手段，将外源基因片段插入表达载体的过程。构建前期的设计过程至关重要，包括目的基因序列的确定、载体的选择、酶切位点选择、引物设计等。用限制酶分别切割目的基因两侧及运载体，然后在DNA连接酶的作用下就形成了基因表达载体。2.实验目的从293细胞cDNA中将目的基因通过PCR扩增和酶切连接构建到病毒载体pCDH-myc-GFP/Puro中。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂LB培养基、Amp或Kana抗生素、50％甘油等。3.2.主要仪器LB平板、1.5mLEP管、10mLEP管、枪头等。4.实验步骤实验步骤包括：引物设计，PCR扩增，酶切，连接、转化，克隆鉴定，测序，质粒小抽，质粒入库等。4.1引物设计4.1.1目的基因序列的确定A.根据NM号查询根据NM号查询基因序列最为简单方便，一个NM号对应一个序列，因此在NCBI中输入NM号查询，然后选择相对应CDS序列即可。解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2B.根据基因名称查询根据名称查询较为不便，因为同一个基因可能有多种剪切异构体，因此需要根据实际情况选择、找出目的基因序列。C.片段内部酶切位点分析将目的基因序列输入序列分析软件，分析内部酶切位点。注意：翻译起始密码子ATG和终止密码子（TAA、TAG、TGA）ATG：如果目的基因前（载体上）没有共表达的序列，则必须在基因序列前加ATG；这种情况多见于剪切异构体的构建中。终止密码子：如果目的基因后没有继续表达的序列，则必须加入终止密码子，选择该基因在该物种中自带的终止密码子即可；如果目的基因后连接其他需要表达的序列，则需要去掉终止密码子。4.1.2载体选择根据构建要求选择，选择合适的载体，主要考虑如下几个方面：A.载体类型载体可分为克隆载体、表达载体，后者又有真核表达载体和原核表达载体之分。依据实验目的选择相应载体（见附件）。解螺旋http://www.helixlife.cn/B.载体原件查看载体上的各类原件是否满足实验要求或与要求冲突，例如标签，启动子类型、多克隆位点等。常用启动子III型启动子（H1、U6等）具有表达效率高、有效的确定终止位置等优点，成为首选；II型启动子适用于pri-miRNA序列中有连续的5个T-导致III型启动子（CMV、Ubi等）终止转录的情况。常用蛋白标签Flag:GATTACAAGGATGACGACGATAAGDYKD...
