解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1蛋白泛素化检测（IP-WB法）1.实验原理泛素（ubiquitin，Ub）是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的蛋白质。它和泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）配合实现对特定蛋白的泛素化修饰，最终达到清除衰老、损伤以及错误折叠的蛋白质,对维持细胞正常的生理功能具有非常重要的作用。另外,某些泛素化修饰反应也能够实现与蛋白质降解无关的功能调控作用。IP-WB法通过免疫共沉淀方法将目标蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。2.实验目的检测目标蛋白P的泛素化3.实验材料3.1.主要试剂目标蛋白抗体（若是带有标签，也可用标签抗体）、ProteinAbeads、ProteinBbeads、HA标签抗体或泛素抗体、蛋白酶抑制剂等.解螺旋http://www.helixlife.cn/3.2.主要仪器离心机、恒温金属浴、酶标仪、电泳仪、凝胶成像系统、Vortex等3.3.其他（请具体写明）需要构建目标蛋白真核表达载体（见过表达载体构建）以及带HAtag的泛素载体4.实验步骤1.将目标蛋白真核表达载体和带HAtag的泛素载体共转染细胞（可以所研究的目标细胞，也可用293T等较好转染和表达的细胞株），步骤见质粒转染。2.24小时后，加入20μM蛋白酶体抑制剂（MG-132），孵育4小时后收取细胞。3.加入预冷的细胞裂解液（使用前加入PMSF和磷酸酶抑制剂），与冰上裂解细胞30min。解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn24.4℃，12000转离心20min，提取上清蛋白至新的1.5mlEP管中，加入1μg目标蛋白抗体，4℃缓慢摇转过夜。5.加入20μlProteinA+Gbeads，继续4℃缓慢摇转4小时。6.4℃，2500转离心5min，小心吸除上清，沉淀中加入1mlPBS洗涤，4℃，2500转离心5min，洗涤步骤重复3-5遍。7.沉淀中加入20μl1xSDS-PAGE电泳上样缓冲液，Vortex轻微震荡重悬沉淀。8.4℃瞬时高速离心将样品离心至管底，与沸水中煮沸10min。此时样品可进一步作WB检测，或暂时不检测，可放于-20℃保存。解螺旋http://www.helixlife.cn/9.上清进而SDS-PAGE电泳，用Westernblotting检测泛素化情况（用HA标签抗体）。10.应用示例文献1,21.SinghR,KarriD,ShenH,etal.TRAF4-mediatedubiquitinationofNGFreceptorTrkAregulatesprostatecancermetastasis.JClinInvest2018;128(7):3129-43.2.LiY,LiL,ChenM,etal.MAD2L2inhibitscolorectalcancergrowthbypromotingNCOA3ubiquitinationanddegradation.MolOncol2018;12(3):391-405.
