解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1基因敲除（CRISPR/Cas）1.实验原理CRISPR/Cas9是一种新型的基因组编辑技术，拥有操作简单，效率高，以及作用靶点多等优势，逐渐成为基因敲除，基因组突变和基因敲除等实验的标准操作工具。Cas9系统能在293T,K562,iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，进而引导非同源重组（NHEJ）或同源重组（HR），效率在3-25%之间。在向导RNA（guideRNA，gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。如果在基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的敲除目标基因。3.实验材料3.1.主要试剂Cas9质粒、LB培养基/LB琼脂培养基、NaCl、Tris‐HCl、T4DNA连接酶等3.2.主要仪器稳压电泳仪、凝胶成像仪、细菌摇床、生化培养箱、PCR仪、高速离心机等解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn24.实验步骤4.1.寻找目的基因的靶标登录在线设计网站CRISPRdirect。靶点挑选要点：1.基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内；2.不同Cas9/gRNA靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建2～3个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。3.N1-N20NGG靠近PAM的碱基对靶点的特异性很重要，前7～12个碱基的错配对Cas9切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行BLAST检测。4.Cas9Nicknase需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距20～30bp的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。4.2.插入片段设计1.插入寡核苷酸序列设计（必须PAGE纯化寡核苷酸）：正向序列5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC...
