16第三部分人Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测1．检测原理Th1和Th2细胞均分泌多种细胞因子:Th1细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β/等;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10其中IFN-γ为Th1最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子。虽然人们一直在努力寻找区分Th1与Th2的特异性的细胞表面标志，但迄今为止，还没有找到公认的细胞表面鉴别标志，所以仍以所分泌的细胞因子来区分Th1与Th2，即：Th1：CD4+IFN-γ+,Th2：CD4+IL-4+同理，Tc1和Tc2也需用IFN-γ和IL-4来区分，即：Tc1：CD8+IFN-γ+,Tc2：CD8+IL-4+其实，我们通常所说的Th1和Th2是指T辅助细胞(严格意义上是Th0细胞)在各种生理与病理条件下分化为Th1和Th2的能力。静息状态(即未受任何刺激，如人的正常生理状态)下，Th0分化为Th1和Th2的能力非常弱，所以外周血中仅含有极少量的Th1和Th2细胞，这时我们所能检测到的IFN-γ和IL-4也微乎其微。而当Th细胞受到外界因素，如刺激素，病原体等刺激，其中Th0即会向Th1或Th2大量分化，具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时，我们检测到的IFN-γ或IL-4也较多。实验中我们检测的Th1和Th2实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。我们通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+Ionomycin(离子霉素)。其中PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物，PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白的表达，进而引起T细胞的活化。在细胞内，PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活，因此在Ionomycin(Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内)的参与下，T16细胞内PKC可被进一步激活。可见，PMA与Ionomycin协同活化T细胞。也有人选用其它刺激剂来活化T细胞，如CD3/CD28协同刺激，PHA刺激等。实验表明，PMA为广谱性刺激，即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活，而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激，则是通过TCR受体的作用，仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞17因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi)，因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。我们通常选用的阻断剂为BFA或Monensin,其中BFA的阻断效果优于Monensin,但由于前者价格较昂贵，现...
