RT-PCRRT-PCR，反转录聚合酶链式反应，是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用OligodT或随机引物经过反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。实验前准备在开始实验前，需准备好实验所用的试剂，如0.1%DEPC溶液，Trizol，氯仿，异丙醇，DEPC水配制的75%乙醇，无RNase-free的纯水，反转录试剂盒、dNTPmix,Taq酶,buffer、凝胶电泳缓冲液等。本次实验所涉及到的仪器和耗材有：ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪，ThermoScientificArktikPCR仪以及F1系列单道移液器和QSP盒装吸头。冷冻离心机，水平电泳槽，电泳仪，离心管，PCR管。首先提取正常小鼠和肝癌小鼠模型的肝脏总RNA，检测其浓度后进行反转录获得cDNA。再以cDNA为模板，通过PCR反应扩增获得大量的p53基因。引物设计本实验使用Oligo6软件设计p53引物。首先登陆NCBI，输入p53的登陆号M13874，获得其CDS等详细信息。复制序列，保存为.seq格式。打开Oligo6软件，打开刚保存的文件，出现Tm、Frq和ΔG窗口。点击Search，选择PrimersandProbes，出现SearchforPrimersandProbes窗口。在该窗口内点击SearchRanges，设置引物搜索范围，上游引物：1-53bp；下游引物：1200-1302bp，产物长度为1000-1200bp，点击ok。点击Parameters，进行更多参数的设置，无特殊需要，可默认，确定完成，开始搜索。在新出现的SearchStatus窗口点击ok可见搜索结果。点击任意一对引物，可在PCR窗口中查看引物的信息。根据GC含量和Tm值，确定比较适合的引物，并保存序列。总RNA提取在装有新鲜动物肝脏组织匀浆中加入相应体积的预冷Trizol，每50-100ng样品加1mlTrizol，充分混匀。静置10min，12000rpm，4°C离心15min。再加入1/5Trizol体积的氯仿，用力颠倒混匀，室温放置3min，可见分层，如此重复几次使液体充分分层。12000×g，4°C离心15min。离心后，溶液分为有机相和水相，中间有一层蛋白质层，RNA在上层水相层。小心地吸取上清，移入新的离心管中。加入1/2Trizol体积的预冷的异丙醇，混匀后室温静置10min。12000×g，4°C离心10min后，可见沉淀。小心地彻底弃上清。将离心管置于离心机中离心数秒，再用移液器小心吸去残留液体。加入1倍Trizol体积的75%乙醇，来回颠倒混匀，使沉淀悬浮...
