编号：2-1主题：RT-PCR概述：RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。目的：检测目的基因的转录产物mRNA的水平原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因的表达。步骤：1.总RNA的提取（以细胞为例）1.1弃去培液，PBS洗2遍，加入1mlTrizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5mlEP管内，静置5min。（Trizol量根据细胞密度可适当调整，建议：6孔板细胞长满~1mlTrizol）1.2加入200μl氯仿（三氯甲烷），用手剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟。（氯仿量为1/5Trizol）1.312000g，4℃，离心15min。1.4仔细转移上层水相到1个新EP管中，不能贪多，约400-500μl。1.5加等体积异丙醇，轻柔混合4～5次，室温放置10分钟。1.612000g，4℃，离心10min。1.7轻轻倒去上清，用20μl枪轻轻吸去残液，沉淀用1ml75%乙醇（0.75ml无水乙醇＋0.25mlDEPC水，现配）洗1～2次，涡旋混匀。1.8吸去上清，5-10分钟空气干燥RNA。（肉眼不能明显看到水分即可）1.9加15-20μlDEPC水，吹打数次，测浓度。注释：mRNA不稳定，很容易讲解，因此mRNA提取过程中要尽量避免RNA酶污染。2.RT：（参照商品化试剂盒说明书）3.PCR：（参照商品化试剂盒说明书）4.电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。5.密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
