大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenentcells）。1实验方法原理：带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过。2实验材料、试剂、仪器耗材：E.coliDH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h。一般经验，1OD600约含有大肠杆菌DH5α109个/mL。2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。3、于4℃用SorvallGS3特头（或与之相当的转头）以4100r/min离心10min，以回收细胞。4、倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。5、每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重悬每份细胞沉淀。6、于4℃用SorvallGS3转头（或与之相当的转头）以4100r/min离心10min，以回收细胞。7、倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。8、每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于-70℃。4注意事项：1.为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。2.在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散，从而使分光光度计读数得到标准化。3.对大多数...
