解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1蛋白磷酸化检测1.实验原理由于蛋白的分子量各异，利用聚丙烯凝胶电泳能够将蛋白初步分离，再利用抗原-抗体特异性结合的特性，用“标记”的抗体结合到磷酸化的目标蛋白上使磷酸化的目标蛋白显影，最终用显影的强度来半定量表示磷酸化的目标蛋白的量2.实验目的检测磷酸化目的蛋白的量.解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂试剂来源磷酸化蛋白酶抑制剂Thermo-pirce公司0.45umPVDF膜Thermo-pirce公司一抗兔抗人CST公司二抗山羊抗兔HRP标记中国北京中杉金桥生物技术有限公司蛋白Marker中国北京中杉金桥生物技术有限公司甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺(ammoniumpersulfate，APS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、TEMED、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(glycine)、溴酚蓝(brophenolblue)Sigma公司3.2.主要仪器仪器名称来源超声粉粹机、电泳仪、制胶板、电泳槽、转膜仪、凝胶成像仪Bio-Red公司4.实验步骤4.1蛋白提取取出细胞置于冰上，弃除培养瓶中的培养基，用预冷的PBS液冲洗三遍后完全吸出PBS液。培养瓶中加入400μl（含40μl磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂）的裂解缓冲液，解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2冰上裂解2h，用细胞刮彻底刮瓶底，并将液体完全吸出全部装入1.5ml的EP管中，按实验分组的情况在EP管上做好标记。置于4℃离心机12000rpm离心15min后用移液枪小心彻底吸取上清液装入1.5ml的EP管中，上清液为蛋白。将各蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液（5×）以4:1的比例充分混合在沸水中煮5min，使蛋白变性。做好标记置于-20℃冰箱保存，需要时进行蛋白定量。4.2蛋白定量①标准蛋白溶液配制：精确称取100mg分析纯牛血清白蛋白完全溶于100ml蒸馏水中，配制成1.0mg/ml的标准蛋白溶液.②以标准蛋白的浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线制作标准曲线。③样品测定：将适当体积的待测蛋白样品加入96孔板，各孔用PBS补充至20μl。将A液与B液按照1:50的比例配置成工作液，各孔均加入200μl，BCA工作液，置于37℃水浴中孵育30min后冷却到室温，以空白管为对照，测量样品在562nm测OD值，根据标准曲线计算样品蛋白的浓度。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.3配胶根据蛋白分子量选择合适浓度的分离胶，5%浓缩胶，将配好的5ml分离胶迅速灌入凝胶玻璃板内，注意均匀灌入不要产生气泡，再加入1ml双蒸水室温放置30min压液面，待分离胶凝后小心倒出双蒸水并用滤...
