解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1shRNA慢病毒载体构建RNAi实验技术的视频介绍，请见解螺旋在线视频课程酸谈实验室之基因表达操作篇：RNAi1.实验原理RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。siRNA可与细胞质中特定的酶形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶是该复合体中的必备成分。在RISC的作用下，siRNA解链成为单链，由其中的反义链特异识别目的mRNA并与之结合。一经结合，细胞内的核酸内切酶就在靶mRNA的近中点位置切害」目的mRNA,被切害」的mRNA片段被核酸外切酶降解后无法正常编码成相应的蛋白质，从而导致功能缺失。RNAi作为一种重要的基因转录后沉默机制，广泛应用于基因功能研究，肿瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究。目前主要有siRNA转染和构建shRNA（慢病毒）表达载体两种技术。前者通过合成靶向目标基因的siRNA序列（19-27bp），然后将siRNA序列转染到细胞里。后者是通过将siRNA转化为shRNA（编码siRNA正义链和反义链，并且之间由一段loop序列隔开），然后将化学合成的shRNA插入到载体中，载体可通过转染进入细胞，或者包装成慢病毒，由慢病毒感染细胞（从而把shRNA带入细胞）。本方案介绍shRNA慢病毒载体的构建。慢病毒包装、慢病毒感染请见解螺旋http://www.helixlife.cn/解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn22.实验目的构建含有针对目的基因的shRNA骨架质粒并包装成慢病毒，感染细胞。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂试剂名称试剂来源Cat.No.DNAoligoGENEWIZBiomigaPlasmidKitBIOMIGAPD1220-02BamHI-HFNEBEcoRI-HFNEBLB培养基/LB琼脂培养基BBISD7002/SD7003CaCL2BBICT1330-500gT4DNAligaseNEBM0202L琼脂糖NBBIAB1004DNAMarkerTIANGEN测序GENEWIZ3.2.主要仪器仪器名称仪器来源Cat.No.稳压电泳仪TanonEPS-300凝胶成像仪TanonTanon1600细菌摇床世平实验设备公司SPH100D生化培养箱上海精宏实验设备有限公司SHP080PCR仪BIOERTC-96/G/H(b)A高速离心机ThermoMicroT7R60mm细菌培养皿海门市蓝天生物实验器材厂1.5ml离心管海门市蓝天生物实验器材厂10ml离心管海门市蓝天生物实验器材厂4.实验步骤4.1shRNA慢病毒载体构建解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn34.1.1siRNA序列设计shRNA序列并于美国国立生物技...
