实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR，简称RT-QPCR,属于Q-PCR的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBRGreenⅠ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法。本视频使用LightCycler®480SYBRGreenIMaster试剂盒介绍SYBRGreenI的非特异性方法。SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链DNA分子结合。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，嵌入至dsDNA，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，PCR扩增不同时期中，dsDNA含量不同，SYBRGreenI荧光信号强度不同。可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，并可根据对照进行相关的计算和分析。实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。试剂包括：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA。使用的试剂盒有：用于合成cDNA第一链的罗氏试剂盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit，包含了cDNA反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。配套LightCycler®480使用的试剂盒LightCycler®480SYBRGreenIMaster，包含了PCR所需的各种实验组分，如1号管中包含热启动TaqDNAPolymerase及反应缓冲液，dNTPmix，SYBRGreenI染料和MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。注意：SYBRGreenIMaster需避光放置。所需仪器与耗材有：罗氏LightCycler®480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的96或384多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的ThermoScientificArktikPCR仪、单道移液器、Nunc冰盒及QSP盒装吸头等。接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的RNA反转录合成cDNA第一链，然后进行实时荧光定量PCR，其中包括：SYBRGreen反应体系的配置；PCR程序设置；运行PCR实验，样品编辑和结果分析。反转录反应首先是反转录合成cDNA第一链：实验操作时注意：所有RNA相关的操作均要佩戴手套，防止RNase污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimermix，总体系13μl，本实验是联合使用anchoredoligodT引物和随机六聚体引物进行的反转录。先配置NTC对照，加入9号管水10μl、6号管的50mMoligodT引物1μl、5号管的0.6mM随机六聚体引物2μl，混匀。然后进行样...
