解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1Treg/Th17平衡1.实验原理流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速定量和分选的技术。用FITC标记的CD4流式抗体和Percp/cy5.5标记的CD25流式抗体染色细胞膜表面表达的CD4、CD25分子，筛选出CD+CD25+的活化的辅助性/诱导性T细胞，再筛选出PE标记的Foxp3阳性的Treg细胞。Leukocyteactivationcocltail可以刺激TH17分泌细胞因子IL-17，IL-17可被破膜剂固定在细胞膜上，然后通过CD4阳性和IL-17阳性检测出Th17细胞。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的检测外周血中Treg/Th17的比例3.实验材料3.1.主要试剂人外周血淋巴细胞分离液，FITC标记的CD4流式抗体，Percp/cy5.5标记的CD25流式抗体，PE标记的Foxp3流式抗体，BB515标记的CD4流式抗体，PE标记IL-17A流式抗体，Foxp3Fix/permbuffer（Biolegend公司），Foxp3/permbuffer（Biolegend公司），Cytofix/CytopermFixation/Permeablizationkit（Biolegend公司），Leukocyteactivationcocktail（Biolegend公司），Stainbuffer（Biolegend公司），RPMI-1640培养基，PBS（pH=7.4）解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.2.主要仪器超净工作台，流式细胞仪，离心机，CO2恒温培养箱4.实验步骤4.1.外周血单个核细胞（PBMC）的分离1.收集样本抗凝外周血，加入1:1体积比的PBS，混匀。2.另取一干净离心管，上述血样等体积的PBMC分离液，将离心管倾斜成一定角度，将上述步骤中抗凝血与PBS的混合液沿管壁缓慢加入，不要震荡，此时血：PBS：PBMC分离液的比例是1:1:1，400g离心20min。3.离心后可见到液体分为4层，分别是血浆层、呈白色云雾状的PBMC层、淋巴细胞层、红细胞及粒细胞层。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.吸取PBMC细胞层，移至干净的离心管中，加入PBS，用移液枪反复轻柔吹打使PBMC悬浮起来，400g离心10min，弃上清。5.重复第4步，离心弃上清后，加入200μLPBS，用移液枪反复轻柔吹打使PBMC悬浮起来成为单细胞悬液。4.2.Treg的检测1.往PBMC的单细胞悬液中加入荧光标记的CD4，CD25流式抗体，4℃避光孵育30min。2.400g离心5min，弃上清，加入PBS，悬浮细胞后，400g离心5min，弃上清，再重复1遍。3.加入250μLFoxp3/perm液，充分混匀，4℃避光孵育20min，400g离心弃上清。4.加入荧光标记的Foxp3流式抗体，4℃避光孵育30min。5.400g离心5min，弃上清，加入PBS，悬浮细胞后，400g离心5min，弃上清，再重复1遍。6....
