解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1RNApulldown实验（生物素标记的磁珠法）1.实验原理首先标记RNA（如生物素探针标记RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（westernblot）或质谱（massspectrometry）检测蛋白。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的检测与RNA（如miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白3.实验材料3.1.主要试剂PierceRNA3'EndDesthiobiotinylationKit（Thermo20163）DEPC水RNase抑制剂3.2.主要仪器PCR仪离心机3.3.其他体外转录的RNA片段4.实验步骤①生物素探针标记RNA的制备a)取出PierceRNA3'EndDesthiobiotinylationKit试剂盒，打开PCR仪；b)用DEPC水溶解RNA，用DEPC水溶解试剂盒中ControlRNA作为阴性对照；c)取对照RNA、目标RNA各5μl,放于PCR管中，每管加1μlDMSO，混匀后置于PCR仪上，85℃5min，取出立即置于冰上5min;d)配制探针标记反应体系：解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2成分体积（μl）water310XRNAligasereactionbuffer3RNase抑制剂1Non-labeledRNA5BiotinylatedCytidineBisphosphate1T4RNALigase2PEG30%15Total30e)混匀，置于PCR仪内，16℃过夜；f)取出PCR管，向每管中加入400μlDEPC水;g)每管加300μl酚氯仿提取标记成功的RNA，离心15min,将上层水相移到新的EP管中。解螺旋http://www.helixlife.cn/②RNA抽提a)用1ml70%乙醇洗涤,8000rpm离心10min,吸净管内液体，空气中晾干RNA；b)每管加20μlDEPC水溶解RNA，后将RNA放于PCR仪中，95℃，5min，取出立即置于冰上备用。③细胞裂解a)弃去培养基，用预冷的PBS洗3次，吸去上清；b)每个培养皿中加入200μl细胞裂解液；c)刮下细胞，将细胞悬液收集至EP管；d)4℃，3000rpm，离心10min；e)转移上清至新的EP管中，置于冰上;f)取10-20μl左右上清至新管中，作为input组。④磁珠预处理a)涡旋混匀beads；b)每管取400μlbeads，置于磁力架上，吸去上清；c)用800μl1Xbinding&washingbuffer,洗3次，吸去上清；⑤RNA与beads结合a)向上一步的beads中加入400μl2Xbinding&washingbuffer；b)向上一步中加入20μlRNA,再补380μlDEPC水，使其终体积为800μl；c)室温慢速旋转20min,使beads与RNA充分结合；d)将上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；e)用800μl1Xbinding&washingbuffer（含RNase抑制剂,1U/μl）,洗3次，吸去上清；f)用细胞裂解液洗一次beads,吸去上清。⑥RNA与蛋白相互作用a)向上一步...
