TUNEL检测细胞凋亡细胞凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。细胞凋亡涉及caspase活化、线粒体跨膜电位下降，位于细胞膜脂内层的磷脂酰丝氨酸转位到蛋白表面，DNA呈规律性断裂等。基于这些特征，多种检测凋亡的方法也迅速发展起来，常用的方法包括形态学检查，分子生物学方法，免疫电泳和细胞学检查。本教材通过TUNEL法检测细胞凋亡，TUNEL，为原位末端转移酶标记技术。其原理是：先增加细胞膜通透性，让rTDT和荧光素生物素标记的dUTP进入细胞内，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的辅助下将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而可进行凋亡细胞的检测。最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。实验前准备在开始实验前，确保所用到的试剂都准备到位。如：0.2%TritonX100，TUNEL检测试剂盒（包含10×TdT酶浓缩液、荧光素标记的1×dUTP、转化剂POD），DAB试剂盒，3%过氧化氢甲醇，磷酸缓冲液PBS等本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得公司提供的移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头，湿盒，恒温箱等本次TUNEL实验按照以下常规步骤来展开，首先样品处理，封闭内源性过氧化物酶干扰后进行细胞通透化。滴加TUNEL反应液反应后POD转换，DAB显色后在显微镜下观察并进行结果分析。样品处理在标有实验组，阳性对照组和阴性对照组的切片上滴加4%不含甲醇的甲醛室温固定10min。弃去甲醛，用PBS洗两次，每次5min。封闭用滤纸擦去周围多余的PBS，滴加3%过氧化氢甲醇，室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶干扰后，弃去将载玻片用PBS洗2次，每次5min细胞通透化去尽PBS后，滴加100μl由PBS配制的0.2%TritonX100。于湿盒中室温孵育5min。孵育结束后，弃去通透液，PBS洗两次，每次5minTUNEL反应按照试剂盒说明书根据实验实际用量配制好标记反应体系。实验组和阳性对照组滴加50μl标记反应混合物，阴性对照组滴加50μl标记溶液，避光孵育30min。孵育结束后，用PBS洗2次，每次10minPOD转化擦去周围多余的PBS，每张切片滴加50μl的转化剂POD，避光反应30min。孵育结束后，PBS洗2次，每次5min。DAB染色取出载玻片，用滤纸擦去周围多余的PBS。滴加新鲜配制的DAB工作液，结合显微镜下观察背景颜色变化，控制显色时间。底面出现适量黄色时，将载玻片放入盛有蒸馏水的切片缸内，水洗终止显色。结果分析阴性对照组细胞状态良好，呈正常的梭形...
