WesternBlottingWesternBlotting，即免疫印迹，是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，它结合了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的特异性。其基本原理是：通过电泳将蛋白组分分开，然后将电泳后凝胶上的蛋白质转移至载体膜上，用封闭试剂封闭载体膜上未吸附蛋白质的区域，最后通过免疫学检测来分析特定的蛋白质表达水平。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其分辨率和灵敏度，广泛地应用于检测特定基因表达产物的正确性，或者比较表达产物的相对变化量。实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材，主要包括：各种凝胶配置液、各种缓冲液、相关抗体、PVDF膜，赛默飞公司的QSP盒装吸头及Nunc冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器等。主要仪器有：ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪、离心机、电泳仪等。接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先制备蛋白样品，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，接着对含有蛋白质的PVDF膜进行免疫学检测，X-胶片显影定影后，扫描图片，最后用IPWIN6.0软件分析结果。蛋白样品的制备按1ml裂解液加10μl的100mmolPMSF，混匀后置于冰上待用。注意：PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，PMSF是剧毒物质，操作时要谨慎。蛋白样品一般来源于基因工程菌或特定的真核细胞，本实验以单层贴壁细胞总蛋白的提取为例。倒掉离心管中的上清，用移液枪吸去残余培养液，注意不要吸走细胞。每管细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，要经常上下颠倒离心管。然后于4℃10000×g离心力离心5min。将离心后的上清分装转移至干净的离心管中，分装至少两份，放于-80℃保存。蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明进行操作，用ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪于波长562nm处检测OD值，绘制标准曲线并计算样品蛋白浓度，取适量上清，加入上样缓冲液，煮沸10min。缓慢恢复至室温后，稍离心，放于-20°C保存。SDS-PAGE电泳凝胶的制备灌胶前，需组装好制胶器，将洗净且干燥的两块玻璃板底端对齐后安放在灌胶支架上。参照12%分离胶配制体系依次加入各个组分，混匀。将配置好的凝胶，沿玻璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡。根据梳子深度确定灌制高度，通常距离矮板至少2cm，灌好后，注入水封胶。此时可按照配方配制5%浓缩胶，注...
