解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1实验名称1.实验原理组织细胞可以用IV型胶原酶，I型DNA酶进行消化，通过研磨后获得单细胞悬液。然而，这种组织单细胞悬液中的细胞种类繁杂，淋巴细胞只是其中一部分，为了研究Th1和Th2细胞的平衡，需要先把其中的淋巴细胞分离出来。Percoll是经过聚乙烯比咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。根据细胞的比重不同，选择合适的percoll离心液的密度梯度，通过梯度离心可以有效的得到浸润的淋巴细胞。流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速定量和分选的技术。用FITC标记的CD4流式抗体染色细胞膜表面表达的CD4分子，刺激混液刺激Th1和Th2细胞因子的表达，并抑制高尔基体分泌细胞因子，用FixandPerm对细胞进行破魔和固定，用APC标记的IL-4流式抗体及PE标记的IFN-γ流式抗体可以通过破膜孔与细胞内的相应细胞因子结合，从而通过CD4+IFN-γ+共同标记处Th1细胞，CD4+IL-4+共同标记处Th2细胞。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的检测组织中Th1/Th1细胞的比例3.实验材料3.1.主要试剂IV型胶原酶，I型DNA酶，Percoll分离液，FITC标记的CD4流式抗体、PE标记的IFN-γ流式抗体，APC标记的IL-4流式抗体，4%多聚甲醛，FixandPerm试剂盒，刺激混液（Sigma），RPMI1640培养基，胎牛血清等解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.2.主要仪器超净工作台，高压灭菌锅，台式离心机，流式细胞仪等4.实验步骤4.1.组织浸润淋巴细胞的分离1.组织要在无菌环境下离体，然后用无菌剪刀将组织剪成3mm3大小的流体碎块，将剪碎的瘤块放入50mL离心管中。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.向装有瘤体碎块的离心管中加入约10mLRPMI1640培养基，IV型胶原酶（0.5-1mg/mL），I型DNA酶（0.3-1mg/mL），吹打混匀后，放入37℃摇床上，185转/min，反应1h。3.用200钼尼龙网将上述离心管中的悬液研磨后过滤到新的干净的离心管中，放入台式离心机中离心，2200转/min，离心7min，弃去上清。4.将沉淀用5mL50%percoll离心液重悬，加入到10mL75%percoll离心液的上层。室温下，将离心管放入台式离心机中，1260g/min，升6降2，离心20min后吸取中层云雾层细胞，加入干净的离心管中，该细胞层即为淋巴细胞层。4.2.流式细胞术检测组织浸润淋巴细胞的Th1和Th2细胞1.将装有淋巴细胞...
