YYSWDB0095蛋白质含量测定紫外光谱280nm和260nm的吸收差法YY-SW-DB-0095蛋白质含量测定紫外光谱280nm和260nm的吸收差法1.范围本方法采用紫外吸收法测定蛋白质含量本方法适用于各类蛋白质适用蛋白质浓度范围为0.1mgmL-11.0mgmL-12.原理2.1蛋白质分子中所含的酪氨酸和色氨酸残基使蛋白质在28Onm下具有最大吸收值这是因为两种氨基酸残基的苯环中含有共轭双键在一定的浓度范围内蛋白质溶液的280nm光吸收值与其浓度成正比因此可用作定量测定但不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同所处的微环境也不同因此不同的蛋白质溶液在280nm的光吸收值也不同但区别不十分明显据统计浓度为1mgmL的1800种蛋白质溶液在280nm处的光吸收值在0.33.0之间平均为1.250.51核酸核苷酸碱基等物质在紫外区也有强吸收且这些物质在生物材料中含量丰富常与蛋白质类相互干扰但二者的紫外吸收特性不一样核酸类物质在26Onm的光吸收比280nm更强而蛋白质正相反因此可利用280nm和260nm的吸收差来计算蛋白质浓度紫外吸收法操作简便快捷不消耗样品低浓度的盐类不干扰测定在生化研究中应用广泛尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测但也有相当的物质对紫外法有干扰如核酸等3.试剂氯化钠4.仪器紫外分光光度计5.试样制备5.1标准蛋白溶液牛血清白蛋白溶液用9mgmL-1的NaCl配制成浓度为1mgmL-1的溶液5.2待测蛋白溶液蛋白质浓度控制在1.5mgmL-12.5mgmL-1范围内6.操作步骤6.128Onm和260nm的吸收差法方法是直接取蛋白质样品选用1cm光径的石英比色杯以相应的溶剂作空白对照分别于26Onm和280nm读光吸收值依据上述经验公式即可求出待测蛋白质样品的浓度7.结果计算经验公式是蛋白质浓度mgmL-11.45A280一0.74A260假设1mgmL-1蛋白质溶液的A2801.08.参考文献1.李如亮主编.生物化学实验.武汉武汉大学出版社1998.37-582.张龙翔等主编.生化实验方法和技术.北京:高等教育出版社1997.136-1443.李建武等合编.生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社1994.150-174
