原位杂交实验1探针的设计与合成1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premierprimer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度p81TGCGGACGAAACAGGAAG18bpp82GCTCAAACAGTGATGCCAGT20bp2)目的片段克隆a.在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：目的PCR片段5μlpGM-T载体（约50ng/uL）1μl10×T4DNALigationBuffer1μlT4DNALigase（3U/uL）1μl无菌去离子水3μl总体积10μlb.轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。c.向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16μl的IPTG（50mg/ml）、40μl的X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。d.将10μl的连接产物加到100μlDH5感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500μl37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。e.挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。f.将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。3)重组质粒的线性化取6μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20μl：质粒6μl10xKBuffer2μlNcoI酶1μl0.1%BSA2μl灭菌水9μl终体积20μl取酶切前后的质粒各4μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。4)探针合成按罗氏DIGRNALabelingKit(SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:纯化的线形质粒1μgRnase-freedH2Oupto13μl10xNTPlabelingmixture2μl10xTranscriptionbuffer2μlRnaseinhibitor1μlSP6RNAPolymerase2μl总体积20μl稍混...
