质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收集全部菌体。3.倾去上清，滤纸吸干。4.加30μlTE缓冲液（10mmol/LTris—HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0）,振荡起菌体。5.加30μlTENS溶液（10mmol/LTris—HCl,pH8.0，1mmol/LEDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。6.加150μl3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。13．37℃水浴30min。14．样品放一20℃冰箱保存备用。三、试剂1．TE缓冲液(10mmol/LTris—HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0)配制方法：Tris1.211gEDTA.Na0.037g用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。2．TENS溶液：(10mmol/LTris—HCl,pH8.0，1mmol/LEDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS)配制方法：NaOHO.4gSDS0.5g加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)配制方法：醋酸钠24.6g用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使...
