解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)1．实验原理荧光共振能量转移技术，是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法，适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。应用原理：将要检测的蛋白（如图X和Y），分别偶联上ECFP和EGFP荧光蛋白，ECFP和EGFP是一对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor）。当用433nm的紫光去激发X融合蛋白时，它能够产生475nm的青色荧光；同样，当我们用475nm的蓝光去激发Y融合蛋白时，它能够产生507nm的绿色荧光。当蛋白X和Y间没有相互作用时（两者的空间距离>10nm），融合蛋白X和Y分别产生相应的荧光而被检测到，如果蛋白X和Y间存在相互作用（两者的空间距离需<10nm），用紫光激发融合蛋白X其产生的青光会被融合蛋白Y吸收，从而产生绿色荧光，这时，在细胞内将检测不到青色荧光的存在。这时因为能量从X融合蛋白转移到了Y融合蛋白，这就是荧光共振能量转移技术。解螺旋http://www.helixlife.cn/较为常用的供体-受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（GFPs）和染料类。绿色荧光蛋解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2白类有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP等，染料类的有Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine等。将供体-受体分子对分别标记在不同的分子上，可以研究蛋白-蛋白、RNA-RNA、蛋白-RNA、蛋白-DNA、DNA-DNA等相互作用，本文以蛋白-蛋白相互作用为例。2.实验目的活细胞内检测蛋白A和蛋白B的相互作用；3.实验材料3.1主要试剂CFP-A基因和YFP-B基因质粒等。3.2主要试剂多光子共聚焦显微镜等。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.实验步骤1.实验所用细胞的培养；2.细胞转染质粒：构建质粒载体CFP-A和YFP-B，将A、B蛋白分别偶联上荧光蛋白CFP和YFP，并将两个质粒共转染到培养的细胞内；3.多光子共聚焦显微镜和FRET观察；1)FRET检测时间：质粒共转染细胞后12h、18h、24h、36h、48h、72h，检测是否发生FRET；2)FRET图像采集：确定FRET配对的激发波长，蓝宝石激光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号，最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的FRET信号；4.标定CFP（供体）和YFP（...
