解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1荧光素酶报告基因实验（luciferaseassay）1.实验原理Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法，也可以用于检测miRNA与其靶基因的靶向作用。2.实验目的验证转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用。3.实验材料3.1.主要试剂荧光素酶报告基因检测试剂盒3.2.主要仪器发光检测仪3.3.其他（请具体写明）与海肾荧光素酶联用还可做双荧光素酶报告基因实验4.实验步骤（1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点（若目标是检测miRNA及其靶基因的靶向作用，则需要预测两者结合位点）。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（如pGL3-basic）中。解螺旋http://www.helixlife.cn/（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5）培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2（7）质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μl1XPBS洗1遍。（8）倾斜96孔板，吸干剩余的PBS。（9）去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温。（10）每孔加50μl稀释好的1XPLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解。（11）白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤（10）的上清液10μl，加入100μl预先混好的LARII，2s后测数据。解螺旋http://www.helixlife.cn/（12）每孔添加100μl预先混好的Stop&GloReagent，静止2s后，测数据。注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。
