原位杂交原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(insituhybridization)，是用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再使用与标记物相应的检测系统，在显微镜或电子显微镜下观察细胞内定位。原位杂交技术可分为直接法和间接法两种。直接法主要用放射性同位素、荧光或酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图,转基因检测,基因表达定位等。并也深入到产前诊断,肿瘤和传染性疾病诊断等临床诊断的领域中。实验前准备在实验开始前，需准备好所需的试剂，如2×、0.5×、0.2×的SSC缓冲液，DAB试剂盒和原位杂交试剂盒（其中包含了蛋白酶K，预杂交液，杂交液，封闭液，兔抗地高辛抗体，HRP-山羊抗兔IgG）本实验所使用的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的F1单道移液器、QSP盒装吸头，湿盒，切片缸，温箱，硅化盖玻片等本教材主要通过间接法原位杂交来展开实验，大体的流程有：样品玻片制备，杂交前处理，杂交，杂交后处理以及显色。样品玻片制备首先制备细胞涂片：将2-3滴PBS重悬的细胞液滴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，培养箱干燥5min。杂交前处理滴加1μg/ml的蛋白酶K稀释液，37°C细胞通透30min后，滴加0.1mol/L的甘氨酸溶液终止消化。预杂交：用吸水纸轻轻吸去多余的液体，滴加20μl的预杂交液，盖上硅化盖玻片，37°C湿盒孵育30min。用0.2×SSC缓冲液室温洗三次，每次洗涤5min。杂交擦去周围多余的液体，滴加20μl的杂交液，盖上硅化盖玻片，将切片置于90°C环境下孵育10min，将切片置于盛有2×SSC缓冲液的湿盒中，37°C孵育过夜。杂交后处理轻轻揭去盖玻片，42°C预热的2×SSC缓冲液洗2次，每次5min；37°C预热的0.5×SSC缓冲液洗1次，每次15min；0.2×SSC缓冲液洗1次，每次15min。滴加封闭液37°C孵育30min，去除多余的液体。滴加兔抗地高辛IgG，湿盒37°C孵育30min。轻轻去除多余的液体，浸泡在PBS中5min。滴加HRP-山羊抗兔IgG，将切片放入湿盒中37°C孵育30min。显色去除多余的液体，滴加新鲜的DAB工作液显色20min后，用蒸馏水终止显色。最后可在显微镜下观察结果。结果分析经过DAB染色后，实验组阳性信号呈棕黄色，位于胞浆中。疑问解答DoctorA，您能再跟我们讲解一下探针的...
