实验六、限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)一、实验目的学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。二、实验原理第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。三、仪器、材料与试剂（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统（二）材料与试剂：HindⅢ限制性内切酶，10×MBuffer，待分析的PCR产物，DL2000DNAMarker，6×LoadingBuffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。四、实验步骤1、HindⅢ限制性内切酶酶切反应体积（10μl），在0.2mlEppendorf管中依次加样：10xMbuffer1μLddH2O5.5μLHindⅢ0.5μLPCR产物3μL37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。2、琼脂糖凝胶电泳配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl酶切产物+1μl上样缓冲液,180V恒压电泳。DNA带负电荷，电泳时DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。五、作业写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。（画图）M12345678910HindⅢ内切酶识别位点：A↓AGCTTTTCGA↑AABAABB20007505002501000100
