解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1稳转细胞株1.实验原理研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过表达或者沉默该基因，建立细胞模型。根据所用方法和目的，可以分为稳转细胞株和瞬转细胞株。稳转细胞即所做的基因编辑不会由于长时间培养或传代而丢失。目前常用的建立稳转细胞株的方法是用携带了基因编辑功能的慢病毒感染细胞，再用抗性进行筛选。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。利用慢病毒的特性，将外源DNA克隆到具有某种抗性的慢病毒载体中并感染宿主细胞，利用载体中所含的抗性标志进行筛选，可得到稳定表达或沉默特定基因的细胞株。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的建立稳转细胞株3.实验材料3.1.主要试剂带有抗性筛选标签（如puromycin）的慢病毒（可根据目的选择，过表达基因/沉默基因/突变基因/敲除基因等）、Opti-MEM培养基、Polybrene、胰蛋白酶等3.2.主要仪器生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、显微镜解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn24.实验步骤4.1.慢病毒感染1.将处于对数期细胞用0.25%胰酶消化，1500rpm离心3min去上清，用培养基悬浮起来，制成细胞悬液。2.将血球技术板洗净擦干，吸取7.5μL细胞悬液，沿盖玻片一边缓慢加入细胞悬液，进行细胞计数。3.调整细胞密度，接种于6孔板中。待细胞贴壁后，轻轻吸去培养基，小心加入1ml含5μg/mlPolybrene的Opti-MEM培养基，再加入计算出的病毒量（病毒所需体积=细胞MOI*种板量/病毒滴度），轻轻混匀后放入细胞培养箱培养。4.培养8h后，吸去上清，加入新鲜培养基，继续放回培养箱中，培养96h。5.若慢病毒带有荧光，可在荧光显微镜下观察荧光效率，由此初步判断感染效率。也可收取部分细胞，qPCR或Westernblot检测一下基因标记的效率。4.2.抗性标签筛选1.往感染好慢病毒的细胞中加入抗生素（如puromycin），抗生素的浓度需事先经预实验确认（细胞最佳的抗性筛选浓度）。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.培养一段时间后（一般24-48h，可通过预实验确认）后，可显微镜下查看，是否剩下的细胞都有荧光。3.取部分细胞，qPCR或Westernblot检测一下基因标记的效率。4.如果对稳转株纯度比较高（基因编辑效率100%），可以进行单克隆筛选。6.应用示例文献1,21.ShiX,RanL,LiuY,etal.KnockdownofhnRNPA2/B1inhibitscellproliferation,invasionandcellcycletriggeringapoptosisincerv...
