解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1质粒转染1.实验原理转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。常用的转染的手段有磷酸钙沉淀法和人工脂质体法。磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生具有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和vanderEbb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质。解螺旋http://www.helixlife.cn/本文介绍磷酸钙沉淀法的步骤，人工脂质体法可根据所购买的脂质体说明书进行操作。2.实验目的将质粒转染到细胞中3.实验材料3.1.主要试剂试剂名称来源Cat.No.血清BI04-001-1A双抗HycloneSV30010胰蛋白酶HycloneSH30042Na2CO3生工生物A500840-0500NaHCO3生工生物A500873-0500NaCl生工生物A501218-0001KCl生工生物A501159-0500解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2Na2HPO4生工生物A501727-0500KH2PO4生工生物A501211-0500Na2HPO4·12H2O生工生物A501725-0500HEPES生工生物HB0264-2503.2.主要仪器仪器名称来源型号生物安全柜苏净安泰BSC-B000IIA2二氧化碳培养箱Thermo311离心机上海卢湘仪公司TP25-ws显微镜OlympusCKX413.3.试剂配制3.3.12×HBS配制成分终浓度HEPES(pH7.05)50mMNa2HPO4·7H2O1.5mMNaCl280mMKCl10mMDextrose12mM用5NNaOH调节pH至7.05，0.22µM滤器过滤除菌，分装后-20℃保存。解螺旋http://www.helixlife.cn/4.实验步骤1.检测质粒浓度和纯度：确定质粒浓度（µg/µl，OD260/OD280在1.75~2.0之间显示无蛋白污染），和纯度（0.8%-1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示质粒为超螺旋单带，无RNA污染）。注：除了质粒，还可以直接转染RAN，如siRNA、miRNA等。2.细胞铺板：通过胰酶消化收集细胞，用适当密度接种细胞于细胞培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80-85％）。将细胞置于含5％CO2解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn3的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即...
