原代小胶质细胞分离及纯化培养protocol实验步骤一．实验目的分离小鼠大脑/脊髓组织，体外进行小胶质细胞分离及纯化培养，进行后期的相关细胞实验。以取小鼠皮质的原代小胶质细胞培养为例。二．耗材及试剂准备小剪刀1把，虹膜剪1把，直镊1把，精细直/弯镊子各1把（备注：以上工具均需高压灭菌才能使用）。试剂神经胶质细胞培养基：DMEM（Highglucose）+10%FBS+1%青/链霉素、胰酶：DMEM（Highglucose）：0.25%EDTA胰酶=4:1、DMEM(Highglucose)、PLL(0.1mg/ml)（过滤除菌）（PLL:多聚赖氨酸）、灭菌水三．实验步骤1.提前一天用过滤除菌的0.1mg/ml的PLL包被培养板，30min后吸出PLL（可重复使用），用灭菌水清洗一次，超净台过夜晾干。2.将P0天（出生24小时内）新生小鼠用75%酒精消毒2次，剪头，PBS清洗一遍，沿中线剪开头盖骨（剪刀上挑，以免剪到脑），取出完整的大脑后迅速置于冰预冷的DMEM(Highglocose)中，在体视镜下用精细直镊子和弯镊子剥离出皮质，剥离干净皮质表面的血管膜，迅速放入新预冷的DMEM(Highglocose)3.5cm皿中。3.用虹膜剪将皮质剪成1立方毫米左右的小组织块。将剪碎的组织吸入15ml离老曹聊科研心管中，放入冰里沉淀1-2min，待组织都沉淀至管底时再小心吸去上清；再用预冷的PBS洗涤组织一次，放冰里沉淀，后吸去上清。4.每只小鼠的皮层加入0.1875%胰酶（0.25%胰酶:PBS=3:1）2ml，轻柔地吹散组织后37℃培养箱中消化20min，每5min晃动一次，使组织和胰酶充分接触。5.消化结束后将组织收集到15ml离心管中，使用巴氏管轻轻吹打组织50-60次，加培养基终止消化后继续吹打50-60次；静置1分钟后用70μm细胞过滤筛过滤上清，再加入4ml培养基后继续使用巴氏管轻轻吹打组织10次，继续过滤。6.1000rpm，离心5min，去上清，加入培养基重悬沉淀，后进行细胞计数。（备注：每个25cm2培养瓶接种2.5*105神经胶质混合细胞）7.2天后半量换液，继而每4-5天半量换液（备注：每隔两天进行十字交叉法慢摇细胞）。8.第14-25天时进行小胶质细胞纯化，回收原有培养基，使用纯化胰酶5mL进行消化，消化30分钟；边消化边观察，消化结束后，加入培养基进行终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，加入回收培养基与新的培养基1:1混合的培养基进行培养，（备注：若要重新接种，使用0.25%胰酶消化五分钟后，接种在多聚赖氨酸包被的培养皿中，接种数为105/cm2）9.使用小胶进行后期相关实验。
