引物设计——基因/miRNA黄娅2017年4月20日目录1、基因序列的下载2、引物的设计及筛选3、miRNA序列的下载4、miRNA引物设计基因序列的下载1.NCBI网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2.qRT-PCR引物下载基因cds（codingsequence）序列mRNA=5'UTR+cds(编码蛋白）+3'UTR基因引物设计原则•1.尽量不含发夹结构、二聚体、错配；•2.引物GC含量在40%~60%之间；•3.sense和anti-sense的Tm比较接近；•4.按照Rating评分由高到低选择（引物可自行编辑）。miRNA序列下载•1.miRBase数据库：http://www.mirbase.org/•2.下载相应物种miRNA的成熟序列插播内容：miRNA-5p与3p的认识•以hsa-miR-145为例：•hsa-miR-145-5p是指从hsa-mir-145前体的5’端臂加工而来，hsa-miR-145-3p是指从hsa-mir-145前体的3’端臂加工而来；•表达水平较高的miRNA后面不加任何符号，而表达水平较低的miRNA后面加上*号，如hsa-miR-1451*。有时带“*”的miRNA就根本不出现。miRNA引物设计•1.miRprimer2软件使用•（见软件说明书）•2.自己动手miRNA引物设计自己动手miRNA引物设计-反转录引物•以hsa-miR-26a为例•成熟序列：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU•颈环序列:•5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'•1.将U全部改成T•TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT•2.后面的6个碱基反响互补后加到颈环序列3'端•5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC•AGCCTA-3'自己动手miRNA引物设计-qRT-PCR引物•miRNA引物设计（茎环法+染料法检测）•设计方法：通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上。•反转录茎环通用序列：•GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC•miRNA序列：•>mmu-miR-99b-5p•MIMAT0000132MusmusculusmiR-99b-5p•CACCCGUAGAACCGACCUUGCG•mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为：•GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG•定量PCR反向引物为：TGTCGTGGAGTCGGC•正向引物为：CACCCGTAGAACCGAC
