解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1AnexinV/7AAD双染色检测细胞凋亡1．实验原理在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。7-AAD是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与AnnexinV联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将AnnexinV-APC（APC标记的AnnexinV）与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞（AnnexinV-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（AnnexinV+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被AnnexinV-APC和7-AAD结合染色呈现双阳性（AnnexinV+/7-AAD+）。2．实验目的检测细胞细胞凋亡。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂试剂名称来源Cat.No.血清BI04-001-1A双抗HycloneSV30010胰蛋白酶HycloneSH30042无水乙醇国药集团化学试剂有限公司10009269AnnexinV/7-AADdoublestainingkit南京凯基公司KGA1026解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.2主要仪器仪器名称来源型号生物安全柜苏净安泰BSC-B000IIA2二氧化碳培养箱Thermo311离心机上海卢湘仪公司TP25-ws显微镜OlympusCKX413.3试剂配制一般使用商业化试剂盒，无需额外配置试剂。4.实验步骤（根据试剂盒说明书操作）1)悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA胰酶消化，终止消化后，1500rpm离心3min,吸去上清，用PBS洗涤细胞1次，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。解螺旋http://www.helixlife.cn/2)取1.0E+05个细胞量的重悬液，离心去上清，500μlBindingbuffer重悬细胞。3)加入5μLAnnexinV-APC,混匀后，再加入5ul7-AAD染液，混匀；室温、避光、反应5～15min后置于冰上。4)在1h内，进行流式细胞仪检测。5)GFP的绿色荧光：FIT通道筛选GFP阳性细胞进行AnnexinV-APC／7-AAD荧光检测。6)AnnexinV-APC的红色荧光：激发波长633nm，最大发射波长660nm。7)7-AAD红色荧光：激发波长Ex=546nm；发射波长Em=647nm。5.典型文献1,21.LuTX,LimEJ,ItskovichS,etal.TargetedablationofmiR-21decreasesmurineeosinophilprogenitorcellgrowth.PLoSOne2013;8(3):e59397.2.FengW,FuY,ZhangY,etal.EstablishmentofstablemultiplemyelomacelllinewithoverexpressedPDCD5anditsproapoptosismechanism.IntJClinExpPathol2015;8(9):10635-43.
