第五章基因工程的基本技术第五章基因工程的基本技术核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术聚合酶链反应（PCR）技术第一节凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移速率的四大因素：1.电泳样品的物理性质影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物的摩擦力越大，泳动速率越小。即泳动率与颗粒的分子大小、介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。1）电荷效应DNA分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。2)分子筛效应具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。表琼脂糖浓度与DNA分离范围3）构型在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状(0C)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这3种构型的分子有...
