细胞培养技术与安全温超玮11-3-2016主要内容一.细胞培养的条件及环境二.细胞培养前的实验准备三.细胞原代和传代培养四.体外培养细胞分型五.细胞培养基本技术六.常见细胞污染及其处理方法七.实验安全一.培养细胞需要什么？•条件：培养基（碳水化合物、无机盐、必需氨基酸、微量元素等）、血清（激素、生长因子等）、消化液（0.25％胰蛋白酶）、缓冲液（磷酸盐等）、抗生素（青霉素、链霉素等）•环境：恒定温度（37℃）、CO2（抑制NaHCO3CO2反应，调节pH）、无菌（提供细胞生长的洁净环境）二.前期试验准备？•培养基（DMEM、1640、DMEM/F12、L-15等）配制和除菌（0.22um过滤）。•血清、胰酶、抗生素的购买和分装。•缓冲液的配制（PBS、Hanks等）和灭菌（高压或0.22um过滤）。•培养器皿（枪头、滴管、培养皿、培养瓶、离心管、试剂瓶等）的灭菌（高压）。•隔离服（高压灭菌-干燥-紫外）、移液器（75%酒精-紫外）。细胞培养用器皿的清洗和消毒一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），121摄氏度，15～30min2、过滤除菌(如：血清的除菌）三.原代培养和传代原代培养•取自体内新鲜组织或细胞并置于体外条件下生长，到第一次传代之前的阶段。特性：•一般可持续培养1-4周。•可见细胞分裂，但不旺盛，呈二倍体核型。•与体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。三.原代培养和传代传代培养•细胞在体外环境中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中在进行培养的过程。特性：•细胞增殖旺盛，在细胞全生命期中持续时间最长。•30代内大部分可维持二倍体核型，为有限细胞系。•传代30-50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，甚至完全停止或衰退凋亡。•可通过转化获得无限繁殖能力，成为无限细胞系。（一）贴壁型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1.成纤维细胞型2.上皮型细胞3.游走细胞型4.多型细胞型四.体外培养细胞的分型•胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。•包括成纤维细胞，中胚层起源的心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞，以及培养中细胞形态与成纤维类似者。1.成纤维细胞型成纤维细胞心肌细胞•细胞呈扁平不规则多角...
