第7章分子育种基因工程育种原理分子定向进化育种理性设计非理性设计2定向进化定向进化（directedevolution）：通过人工合成或借助于重组DNA技术，人为制造大量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子，甚至是一些生物体中的小分子。分类理性设计非理性设计分子定向进化育种第一节理性设计第二节非理性设计（定向进化）第三节定向进化文库的筛选方法（略）第四节酶分子工程的应用和发展前景第一节理性设计理性设计：根据目标蛋白的催化部位和催化机理，对要突变的位点精心设计，改变分子中特定氨基酸，从而获得与酶特异性相关的关键残基或结构元件。理性设计的具体方法1.PCR技术2.寡核苷酸引物介导的定点突变3.PCR介导的定点突变4.盒式突变法5.化学合成法1、PCR技术PCR：体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特异地扩增目的DNA片段。能通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生物学研究提供了强大的工具。模板DNA95℃50℃引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶72℃第1轮结束95℃第2轮开始72℃95℃50℃TaqTaqTaqTaq第2轮结束模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCRPCR扩增曲线扩增曲线PCR反应体系与流程反应体系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR缓冲液1.5～4mMMg2+0.2mMdNTP（dGTP,dTTP,dCTP,dUTP）反应流程预变性变性退火延伸延伸完全终止25～35循环PCR扩增特异性的主要影响因素（1）引物量：—每条引物的浓度0.1~0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会（2）酶及其浓度：—浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少（3）dNTP的质量与浓度—注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配—高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性（4）Mg2+浓度—Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响—在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜—Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应...
